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微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)，性能優(yōu)良的菌種是實(shí)現(xiàn)生物制品經(jīng)濟(jì)高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。高通量篩選技術(shù)以自動(dòng)化操作系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，依靠靈敏快速的檢測(cè)儀器采集信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)大批量的樣品。因此，采用高通量篩選技術(shù)進(jìn)行菌種選育能夠更高效地獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株，提高生物制造企業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。

高通量培養(yǎng)新裝備：帶有先進(jìn)傳感器的八聯(lián)微型生物反應(yīng)器

在菌種選育中，培養(yǎng)過(guò)程的微型化是提高篩選通量的重要手段，通過(guò)縮小培養(yǎng)裝置不僅可以減少人工和材料成本，還可以增加實(shí)驗(yàn)的平行性。理想的微培養(yǎng)裝置應(yīng)該是能夠準(zhǔn)確模仿大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程，真實(shí)地反應(yīng)微生物的生理代謝和生產(chǎn)能力。在高通量篩選模型中，傳統(tǒng)的復(fù)篩方式是搖瓶培養(yǎng)，但是其存在數(shù)據(jù)密度低，培養(yǎng)條件不能調(diào)控、過(guò)程參數(shù)無(wú)法在線實(shí)時(shí)采集等問題，因此在對(duì)于發(fā)酵罐菌株性能驗(yàn)證存在一定的放大局限性。微型生物反應(yīng)器保留了傳統(tǒng)生物反應(yīng)器的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能，體積介于搖瓶和微孔板之間，不僅帶有攪拌槳與進(jìn)氣管，還配有光化學(xué)pH和DO傳感器，能夠?qū)Υ笮蜕锓磻?yīng)器的特征進(jìn)行完全模擬，并同時(shí)對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行運(yùn)轉(zhuǎn)，是進(jìn)行細(xì)胞株篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化和工藝優(yōu)化的重要設(shè)備。該論文將自行研制開發(fā)的八聯(lián)平行微反應(yīng)器(圖1)引入到高通量篩選模型中，用于替代復(fù)篩過(guò)程的搖瓶(圖2)，從而在保證篩選通量的基礎(chǔ)上，提高菌株性能驗(yàn)證的可放大性。

圖1. ?八聯(lián)微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)

圖2??菌種高通量篩選流程圖

首先，通過(guò)冷模實(shí)驗(yàn)對(duì)微反應(yīng)器上非侵入式pH和DO光傳感器的應(yīng)用條件進(jìn)行優(yōu)化，表明溫度和外界光會(huì)對(duì)pH和DO的熒光測(cè)定產(chǎn)生顯著影響，因此需要在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中維持恒定的檢測(cè)溫度以及對(duì)罐體進(jìn)行遮光預(yù)處理。其次，通過(guò)熱模實(shí)驗(yàn)在微反應(yīng)器中對(duì)三種常規(guī)微生物(大腸桿菌、畢赤酵母和擬干酪乳桿菌)進(jìn)行培養(yǎng)，表明微反應(yīng)器能夠?qū)崿F(xiàn)過(guò)程pH和DO的檢測(cè)和控制，能獲得比搖瓶更好的細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)以及過(guò)程代謝監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。最后，將八聯(lián)平行微反應(yīng)器和傳統(tǒng)搖瓶分別作為高通量L-乳酸生產(chǎn)擬干酪乳桿菌高產(chǎn)菌株的復(fù)篩工具，通過(guò)微孔板初篩2500份突變混合菌株，其中184個(gè)混合菌株孔中表現(xiàn)出有機(jī)酸生產(chǎn)性能，而且21個(gè)混合菌株孔中的有機(jī)酸產(chǎn)量高于其親株。接著將產(chǎn)量最高的58號(hào)孔和103號(hào)孔分別在平板上進(jìn)行單菌落分離，總共獲得59個(gè)單克隆進(jìn)行后續(xù)的微反應(yīng)器和搖瓶復(fù)篩。通過(guò)微反應(yīng)器獲得4個(gè)突變株，其L-乳酸產(chǎn)量高于親株15%，而搖瓶培養(yǎng)則顯示在上述4個(gè)突變株之外，另有2個(gè)突變株的L-乳酸產(chǎn)量提高幅度大于15%。將這6個(gè)突變株都進(jìn)行5 L反應(yīng)器培養(yǎng)驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)微反應(yīng)器獲得的4個(gè)突變株確實(shí)能夠在5 L反應(yīng)器中也表現(xiàn)出L-乳酸產(chǎn)量的提升，但是搖瓶獲得的額外2個(gè)突變株則與親株產(chǎn)量接近或略微降低。上述結(jié)果表明，相對(duì)于傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)，微反應(yīng)器能夠提供接近于大規(guī)模反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境，篩選所得突變株的生理代謝特性能夠更好地適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，其生產(chǎn)性能也更適合于放大到更大規(guī)模的反應(yīng)器中。綜上所述，該研究中所使用的自制八聯(lián)微型生物反應(yīng)器，能夠很好地替代傳統(tǒng)搖瓶在高通量篩選中作為復(fù)篩的培養(yǎng)裝置，不但能夠保證相對(duì)高的篩選通量，還能夠有效地提高篩選的準(zhǔn)確率和突變株生產(chǎn)能力的可放大性。

文獻(xiàn)來(lái)源：Xiwei?Tian, Gang?Zhou, Weifei?Wang, Ming?Zhang, Haifeng?Hang,?Ali?Mohsin, Ju?Chu, Yingping?Zhuang, Siliang?Zhang. Application of 8-parallel micro-bioreactor system with non-invasive optical pH and DO biosensor in high-throughput screening of l-lactic acid producing strain. Bioresources and Bioprocessing, 2018, 5: 20.

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